ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86053-01(5×50ul)/BFNC86053-02(20×50ul)

ClearColi K12 Electro  Cell                                       50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                               10μl

恢復(fù)培養(yǎng)基                                                               50ml/瓶

保存條件(保質(zhì)期)：                                        -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^–λ^–?endA^–?recA^–frr181 msbA52 ?gutQ ?kdsD ?lpxL ?lpxM ?pagP ?lpxP ?eptA

產(chǎn)品說明

ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞只能用于電擊轉(zhuǎn)化，不能用于熱激轉(zhuǎn)化。ClearColi K12菌株來源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突變，導(dǎo)致ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖（LPS）被修飾:LPS的低聚糖鏈被刪除，同時(shí)LPS的兩個(gè)?；溡脖粍h除，進(jìn)而破壞了ClearColi K12大腸桿菌的內(nèi)毒素信號(hào)通路，使得從該細(xì)胞中提取的蛋白或質(zhì)粒DNA中的內(nèi)毒素含量極低，提取的無內(nèi)毒素質(zhì)粒廣泛應(yīng)用于后續(xù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)化。ClearColi K12同時(shí)缺失核酸內(nèi)切酶 (endA)和重組酶 (recA)，提高了質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量和質(zhì)量。

青旗生物開發(fā)的ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×10⁷ cfu/μg DNA。

ClearColi K12電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞

操作方法

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲(chǔ)存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上5分鐘，待其瀝干水分，正置5分鐘，待乙醇揮發(fā)干凈立即插入冰中，壓實(shí)冰面，電極杯頂離冰面0.5 cm以方便蓋上杯蓋，冰中靜置5分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的ClearColi K12電擊感受態(tài)細(xì)胞插入冰中5 分鐘，待其融化，加入目的DNA ，并用手bo打EP管底輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡，立即插入冰中。

   A. 測(cè)定轉(zhuǎn)化效率使用1 μl 10 pg/μl的對(duì)照質(zhì)粒 pUC19；

   B. 對(duì)于未知來源或組分不明的質(zhì)粒DNA，請(qǐng)用乙醇沉淀DNA后加入適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM              EDTA)重懸，DNA濃度不超過100 ng/μl，體積不超過5 μl/50 μl感受態(tài)。

3. 用200 μl槍頭(用刀切除0.5cm槍尖)將感受態(tài)-DNA混合物快速移到電擊杯中，避免產(chǎn)生氣泡，蓋上杯蓋。

4. 啟動(dòng)電轉(zhuǎn)儀，設(shè)置參數(shù)：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此為BioRad 電轉(zhuǎn)儀推薦參數(shù)，也可按所用電轉(zhuǎn)儀推薦的參數(shù)操作），將電擊杯快速放入電轉(zhuǎn)槽中，電擊完成快速插入冰中。

5. 2分鐘后從冰中取出電擊杯，放室溫，加入1ml不含抗生素的無菌恢復(fù)培養(yǎng)基（室溫），用1ml 槍吹吸電擊杯底部數(shù)次混勻后，轉(zhuǎn)移到50 ml離心管（BD Falcon 50 ml錐形離心管等），向離心管中補(bǔ)加恢復(fù)培養(yǎng)基（室溫）至10 ml。37℃，225 rpm復(fù)蘇60分鐘。

6. 5000 rpm離心一分鐘收菌，重懸后取100-200 μl涂布到含相應(yīng)抗生素的LB（務(wù)必使用高鹽培養(yǎng)基平板，不可用2YT，SOB，SOC等低鹽培養(yǎng)基）平板上（因菌量較大，若全部涂板請(qǐng)選用直徑15cm培養(yǎng)皿2-5個(gè)）。將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36-48小時(shí)（培養(yǎng)24小時(shí)后可看到很小的克隆）。

LB培養(yǎng)基1L(PH:7.0):                

Yeast Extract     5g                      

NaCl           10g

Tryptone        10g

注意事項(xiàng)

1. 因ClearColi K12細(xì)胞壁外層的脂多糖（LPS）被修飾，細(xì)胞易死亡，不易保存，平板菌在4度存放時(shí)間應(yīng)不超過1周。且適合在高鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

2. ClearColi K12電擊感受態(tài)效率很低，不適用于構(gòu)建質(zhì)粒使用，一般用來擴(kuò)繁質(zhì)粒，提取高質(zhì)量的無內(nèi)毒素的質(zhì)粒；若構(gòu)建質(zhì)粒，請(qǐng)選用DH5a、*0等轉(zhuǎn)化效率較高的感受態(tài)細(xì)胞。

3. ClearColi K12菌株生長(zhǎng)緩慢，平板在37度培養(yǎng)時(shí)間在36-48小時(shí)之間。

4. 加入DNA時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的1/10。

5. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞加入電擊杯應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，氣泡會(huì)增加弧光放電風(fēng)險(xiǎn)。

6. 當(dāng)DNA不純或存在鹽，乙醇，蛋白及緩沖液等污染時(shí)，轉(zhuǎn)化效率急劇下降。

7. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導(dǎo)，增大在含有細(xì)胞和DNA的溶液中產(chǎn)生電流和弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

8. 若轉(zhuǎn)化大質(zhì)粒或想獲得較高轉(zhuǎn)化效率，推薦使用高純質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。質(zhì)粒增大一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。

9. 對(duì)于連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，盡量轉(zhuǎn)化前乙醇沉淀DNA后用適量TE緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產(chǎn)物，保證DNA濃度不超過100 ng/μl。過高濃度連接產(chǎn)物或過大體積連接產(chǎn)物會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率，增加弧光放電的風(fēng)險(xiǎn)。

10. ClearColi K12菌株的細(xì)胞壁被修飾過，細(xì)胞比較脆弱，混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作，吸取感受態(tài)細(xì)胞時(shí)避免用力過猛，以免剪切力過大損傷細(xì)胞膜，降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少用于涂板的菌量。

11. 電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞盡量保存在-80℃以下，高于-80℃超期儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率會(huì)下降。